2.1.复苏 在开始复苏前，将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好，已确保尽快完成复苏过程。 将冻存管从液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管，70%乙醇擦拭进行消毒。 使用移液管将冻存管中含有iPS细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的完全培养基的15mL离心管中，过程必须轻柔防止吹散细胞团。 室温300g离心5min。 吸出培养基，确保细胞团完整。 然后缓慢加入1mL完全培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。 轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。 2.2.传代 当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。 传代前， 准备 37 ℃预热好的好无钙镁 PBS 溶液及消化液，完全培养基。 吸走上清，并加入 37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。 加入适量（按 6 孔板每孔加 1ml，6cm 皿加 2ml，10cm 皿加 3ml 的量）的 37℃预热好的消化液。 37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养 皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。 加入适量的完全培养基终止消化。 移入离心管，300g离心5min， 离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。 传代比例为 1：6—1：8，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632，终浓度为10μM。 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632，但培养基需提前预热）。 2.3.冻存 当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。 传代前， 准备 37 ℃预热好的好无钙镁 PBS 溶液及消化液，完全培养基。 吸走上清，并加入 37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。 加入适量（按 6 孔板每孔加 1ml，6cm 皿加 2ml，10cm 皿加 3ml 的量）的 37℃预热好的消化液。 37℃放置1-2min，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。 加入适量的完全培养基终止消化。 移入离心管，300g离心5min。 离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。 使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团，然后将细胞悬液转移至冻存管，冻存按 6 孔板每孔冻 1 支，6cm 皿冻 2-4 支，10cm 皿冻 6-12 支（冻存液为：90% iPS细胞完全培养基与 10%的DMSO。
